Δημήτρης Χατζημπούγιας MD, MSc, PhD
Εξιδικευμένες Τεχνικές Στην περίπτωση που η συνηθισμένη επεξεργασία και μικροσκοπική ανάλυση δεν δώσουν ένα οριστικό διαγνωστικό αποτέλεσμα, υπάρχει ένας σημαντικός αριθμός επιπρόσθετων τεχνικών που δύναται να χρησιμοποιηθούν ώστε να βοηθήσουν στη διάγνωση. Παρακάτω αναλύονται οι εξής:
•Ειδικές χρώσεις (Ιστοχημεία)
•Ανοσοϊστοχημεία (IHC)
•Μοριακή Διαγνωστική
1. Βασικές (Αιματοξυλίνη-Εωσίνη) & Ειδικές χρώσεις (Iστοχημεία) Ο πιο συνηθισμένος χρωστικός παράγοντας είναι η χρώση αιματοξυλίνης-εωσίνης. Η χρώση αυτή αποτελείται από έναν βασικό χρωστικό παράγοντα (αιματοξυλίνη) και από έναν όξινο χρωστικό παράγοντα (εωσίνη), οι οποίοι αντιδρούν με βασικά και όξινα κυτταρικά τμήματα στον ιστό δίνοντας μωβ και ροζ χρωματισμούς. Κατά τη διαδικασία αυτή, οι ιστοπαθολόγοι (παθολογοανατόμοι) αξιολογούν τις χημικές ιδιότητες του ιστού που εξετάζουν επιλέγοντας διάφορους χρωστικούς παράγοντες, οι οποίοι θα χρωματίσουν τις αντίστοιχες ιδιότητες του ιστού. Οι παράγοντες αυτοί εφαρμόζονται στις λεπτές τομές των ιστολογικών δειγμάτων που αναλύονται πάνω σε γυάλινα πλακίδια και επιτρέπουν στον ιστοπαθολόγο να δει τα κύτταρα στο μικροσκόπιο. Άλλες χρώσεις χρωματίζουν το λίπος, διάφορες ιστολογικές ίνες, διάφορους τύπους βλέννης, μικροοργανισμούς, πρωτεΐνες κλπ. Ενδεικτικά μερικές τέτοιες ιστοχημικές χρώσεις: – Van Gieson – Van Gieson-Virchoff – Τριχρωμική Masson – PAS – PAS-διαστάση – Alcian Blue – Ερυθρό του Congo
2. Ανοσοϊστοχημεία Η ανάπτυξη της ανοσοϊστοχημείας αποτελεί μια μεγάλη, πρόσφατη εξέλιξη στον τομέα της ιστοπαθολογίας. Ενώ οι ιστοχημικές χρώσεις αποτελούν έναν σχετικά απλοϊκό και, στις περισσότερες περιπτώσεις, σχετικά γενικό τρόπο χρωματισμού των διαφόρων τμημάτων του ιστού, οι ανοσοϊστοχημικές χρώσεις είναι, συγκριτικά, πολύ περισσότερο στοχευμένες ως προς το τι χρωματίζουν. Η τεχνική της ανοσοϊστοχημείας λειτουργεί με την σύνδεση ενός χρωστικού παράγοντα με ένα αντίσωμα το οποίο θα ενωθεί με έναν συγκεκριμένο τύπο πρωτεΐνης επάνω ή μέσα στο κύτταρο (σχέση αντιγόνου-αντισώματος). Τα αντισώματα μπορούν να παρομοιαστούν με κλειδιά τα οποία ανοίγουν μονάχα μια συγκεκριμένη κλειδαριά (δηλαδή μια κυτταρική πρωτεΐνη ή αντιγόνο). Υπάρχουν εκατοντάδες διαθέσιμα αντισώματα, κάτι που επιτρέπει τη χρώση εκατοντάδων ή και χιλιάδων διαφορετικών πρωτεϊνικών τύπων. Έτσι, ενώ μια ειδική χρώση μπορεί να επιτρέψει στον παθολογοανατόμο (ιστοπαθολόγο), για παράδειγμα, να καταλάβει αν ένα κύτταρο είναι καρκινικό, η ανοσοϊστοχημεία μπορεί να εντοπίσει από ποιο όργανο στο σώμα προήλθε το συγκεκριμένο κύτταρο και πόσο επιθετικά μπορεί να συμπεριφερθεί ο καρκίνος. Επιπρόσθετα, οι χρωστικές ουσίες που συνδέονται στο αντίσωμα που χρησιμοποιείται για αναγνώριση, δύναται να τροποποιηθούν, για παράδειγμα με τη χρήση διαφορετικών χρωμάτων ή ακόμη και φθοριζόντων χρωστικών, ώστε να είναι πιο εύκολη η παρατήρηση στο μικροσκόπιο.
3. Μοριακή Διαγνωστική Ως απότοκο της εκρηκτικής αύξησης των διαθέσιμων πληροφοριών σχετικά με το κυτταρικό DNA (το γενετικό υλικό κωδικοποίησης) που προήλθε ως αποτέλεσμα της ολοκλήρωσης της χαρτογράφησης του Ανθρώπινου Γονιδιώματος, εντοπίζεται ένας ολοένα αυξανόμενος αριθμός γονιδίων τα οποία, στην περίπτωση που είναι ελλαττωματικά, είναι δυνατό να εμπλέκονται στην εμφάνιση ασθενειών, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου. Το γεγονός αυτό αρχίζει να αλλάζει τον τρόπο που γίνονται αντιληπτές, διαγιγνώσκονται και θεραπεύονται οι ασθένειες. Ο όρος «Μοριακή Παθολογική Ανατομική» είναι ένας όρος-ομπρέλα για την ανάλυση του γενετικού υλικού (χρωμοσώματα και το DNA τους) των κυττάρων και αρχίζει να γίνεται ένας όλο και συχνότερος παράγοντας που ζητείται κατά την ιστοπαθολογική εξέταση ενός υποβληθέντος ιστού. Μια υποενότητα της μοριακής παθολογίας είναι και η κυτταρογενετική, η ανάλυση δηλαδή των χρωμοσωμάτων (η μορφή με την οποία εντοπίζεται το DNA στον πυρήνα του κυττάρου). Οι δυο τεχνικές που χρησιμοποιούνται συχνότερα στην μοριακή παθολογία και την κυτταρογενετική είναι ο υβριδισμός in situ (FISH) και η άμεση αλληλούχιση του DNA. Ο in situ υβριδισμός χρησιμοποιείται για την χρώση χρωμοσωμάτων με στόχο την αποκάλυψη περιοχών στις οποίες γονίδια πιθανώς να έχουν διαγραφεί, σπάσει ή να επαναλαμβάνονται. Φθορίζοντες ανιχνευτές ενώνονται σε συγκεκριμένες αλληλουχίες του DNA (μέρη συγκεκριμένων γονιδίων), οι οποίες επιτρέπουν τυχόν ελλαττωματικά γονίδια να γίνουν ορατά κάτω από έναν συγκεκριμένο τύπο μικροσκοπίου. Αντίστοιχα, η άμεση αλληλούχιση του κυτταρικού DNA είναι ενας τρόπος να παρατηρήσει κανεις μεμονομένα γονίδια ή ομάδες γονιδίων με στόχο να ανιχνεύσει και κατονομάσει ποια συγκεκριμένη μετάλλαξη εμφανίζεται στον όγκο ενός συγκεκριμένου ασθενούς. Αυτό μπορεί να επιτευχθεί είτε με τον παραδοσιακό τρόπο (αλληλούχιση κατά Sanger, τριχοειδή ηλεκτροφόρηση), ή με την νεότερη και πολύ ταχύτερη μέθοδο γνωστή ως Αλληλούχιση Νέας Γενιάς. Η Χρησιμότητα των Ιστοπαθολογικών (Ιστολογική Εξέταση) & των Μοριακών Εξετάσεων (π.χ. ανίχνευση γονιδιακών μεταλλάξεων – Κυτταρογενετική) Για να αντιληφθεί κανείς τη χρησιμότητα της Παθολογικής Ανατομικής (Ιστοπαθολογίας) και της Κυτταρογενετικής αρκεί να λάβει κανεις ως παράδειγμα τον καρκίνο του μαστού. Η Ιστοπαθολογία δύναται να προσφέρει μια διάγνωση σχετικά με 1. το είδος του καρκίνου του μαστού που έχει μια ασθενής, 2. πόσο έχει εξελιχθεί, 3. κατά πόσο είναι πιθανό ή όχι το να πρόκειται για όγκο επιθετικής μορφής καθώς επίσης και 4. αν θα ανταποκριθεί σε ορμονικές και στοχεύουσες θεραπείες. Η Κυτταρογενετική εμπλουτίζει τις παραπάνω πληροφορίες ανιχνεύοντας κατά πόσο ο ασθενής διαθέτει κάποιο ελλαττωματικό γονίδιο το οποίο προκάλεσε προδιάθεση στην ανάπτυξη καρκίνου του μαστού. Αν ένα τέτοιο γονίδιο όντως υφίσταται, τότε σημαίνει πως η ασθενής έχει αυξημένη πιθανότητα εμφάνισης καρκίνου και στον άλλο μαστό, όπως επίσης και αυξημένη πιθανότητα εμφάνισης συγκεκριμένου τύπου καρκίνων (π.χ. των ωοθηκών). Έχει επίσης επιπτώσεις και στους άμεσους συγγενείς και απογόνους. Έχουν κληρονομήσει το ελαττωματικό γονίδιο και αν ναι, ποιες είναι οι πιθανότητες να εμφανίσουν καρκίνο στο μέλλον; Με την άμεση αλληλούχιση του ελλαττωματικού γονιδίου/ων, οι άμεσοι συγγενείς μπορούν να εξεταστούν αναφορικά με τη μετάλλαξη, ύστερα φυσικά από τη συγκατάθεση τους, κάτι που επιτρέπει να λάβουν προληπτικά μέτρα έτσι ώστε οι πιθανότητες που έχουν να εμφανίσουν έναν όμοιο καρκίνο στο μέλλον να ελαχιστοποιηθούν. Τέλος, αναπτύσσονται ορισμένες θεραπείες οι οποίες θα στοχεύουν το προϊόν της μετάλλαξης ορισμένων συγκεκριμένων γονιδίων στον ασθενή.